Het principe van PCR

De polymerase ketting reactie is gebaseerd op de wijze waarop in de natuur een cel het DNA vermenigvuldigt bij de celdeling. Het DNA wordt hierbij volledig en exact gekopieerd zodat elke dochtercel precies dezelfde erfelijke informatie krijgt als de moedercel. Het was de biochemicus K. Mullis die deze reactie als eerste in een proefbuis deed opgaan, een prestatie die hem in 1993 de Nobelprijs voor Geneeskunde opleverde.


Moleculaire technieken maken gebruik van nucleïnezuren. In het moleculair biologisch laboratorium wordt het DNA of RNA uit de cel of het virus geïsoleerd door verhitting of met behulp van oplossingen die cel- en kernwand lyseren.

 

In een eerste fase wordt het dubbelstrengs DNA gesplitst in twee ketens enkelstrengs DNA ("denaturatie"). Dit gebeurt door een verhoging van de temperatuur tot 94°C, waarbij de waterstofbruggen tussen beide ketens verbroken worden, terwijl de covalente bindingen onaangetast blijven. Deze twee enkelstrengs DNA-ketens dienen als mal voor de aanmaak van twee complementaire DNA-ketens. Het enzyme dat hiervoor verantwoordelijk is, is het DNA-polymerase. Het DNA polymerase is slechts werkzaam indien het een startpunt vindt in de vorm van een stukje dubbelstrengs DNA. In de PCR wordt hiervoor gebruik gemaakt van zogenaamde "primers". Dit zijn kleine stukjes enkelstrengs DNA, meestal ongeveer 20 tot 40 basen lang, die precies complementair zijn aan de uiteinden van het stuk DNA waarin we geïnteresseerd zijn.

 

Na het binden van de primers ("annealing") aan het gedenatureerde DNA, kan het DNA-polymerase beginnen met de aanmaak van een complementaire DNA-streng, met als startpunt het kleine stukje dubbelstrengs DNA ter hoogte van de primer ("extension"). Het enzyme plaatst één voor één de complementaire nucleotiden in en bindt deze vervolgens aan elkaar. Het principe van de baseparing zorgt ervoor dat de gevormde DNA-streng volledig complementair is aan zijn mal. Zo ontstaan, vanaf de primer, twee nieuwe dubbelstrengs DNA-ketens, volledig identiek aan de oorspronkelijke moedermolecule.

 

Dit hele proces van denaturatie, annealing en extension wordt een aantal keren herhaald. De nieuwgevormde DNA-strengen fungeren hierbij in de volgende cyclus als mal voor de productie van nieuwe strengen.
Bij elke cyclus verdubbelt de hoeveelheid DNA. Er is dus een exponentiële vermenigvuldiging van het op te sporen stukje DNA. Theoretisch zijn er na 20 cycli reeds een miljoen kopieën van het DNA-preparaat en na dertig cycli een miljard.

 

De exponentiële toename van het target-DNA gaat echter niet onbeperkt door. Na een zekere tijd neemt de efficiëntie van de reactie af. Gemiddeld zijn er geen 20, maar 25 cycli nodig om tot een miljoen kopieën van het oorspronkelijke molecule te komen.